1 引 言
如同在地球上一樣，微生物在飛船上是廣泛存在的。俄羅斯載人航天的經(jīng)驗(yàn)證明隨著飛行時(shí)間的延長，飛船中微生物的危害會(huì)越來越嚴(yán)重 [1-3] 。在太空中微生物的危害對(duì)人體而言主要是影響乘組健康，作為病原體引起感染、過敏 [4] ；同時(shí)微生物能釋放有害氣體，成為間接的致病源；對(duì)飛船系統(tǒng)而言，一些生物降解類微生物能夠降解飛船材料、腐蝕儀器儀表，影響飛船硬件設(shè)備穩(wěn)定性致使儀器及系統(tǒng)失靈等 [5] 。因此微生物快速鑒定技術(shù)對(duì)于評(píng)估飛船環(huán)境意義重大。
目前，國際空間站主要使用傳統(tǒng)培養(yǎng)法在軌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，而更細(xì)致的分類鑒定受到座艙條件的限制只能在地面進(jìn)行。多年來 NASA 一直在尋求在軌免培養(yǎng)微生物快速鑒定方法 [6] 。一方面免培養(yǎng)法較培養(yǎng)法能快速、準(zhǔn)確、靈敏地反映環(huán)境中微生物的多樣性，在微生物檢測(cè)和多樣性研究研究中得到了廣泛的應(yīng)用 [7] ；另一方面，培養(yǎng)法可能會(huì)低估微生物種群的數(shù)量，因?yàn)槟承┪⑸锞哂蟹桥囵B(yǎng)存活能力，或需要特殊培養(yǎng)條件 [8，9] 。盡管如此，免培養(yǎng)法在空氣微生物多樣性研究領(lǐng)域尚未得到廣泛應(yīng)用，其主要原因在于沒有有效的適于免培養(yǎng)應(yīng)用的空氣微生物采樣及元基因組 DNA 提取方法。
本文優(yōu)化了微孔濾膜采集空氣微生物條件，建立了元基因組 DNA 快速提取方法，并通過革蘭氏陰性菌-大腸桿菌和革蘭氏陽性菌-金黃色葡萄球菌驗(yàn)證，所得 DNA 滿足 PCR 擴(kuò)增需要，為空氣微生物免培養(yǎng)快速鑒定奠定了基礎(chǔ)。
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 菌種
大腸桿菌（Escherichia coli ）和金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus），兩者均為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。
2.1.2 儀器
生物安全柜（BHC-1300IIA2）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（CT14RD）、循環(huán)水多用真空泵（SHB-3，10L/min）、溫度梯度 PCR 儀、智能蒸汽滅菌器（VPL-A5032）、過濾式空氣采樣器、微孔濾膜（0.22μm 和0.45μm）。
2.1.3 試劑
TE（100mmol/L Tris.Cl，10mmol/L EDTA，pH8.0）、試劑盒 1：土壤基因組 DNA 快速提取試劑盒（離心柱型）、試劑盒 2：超純土壤基因組 DNA 提取試劑盒、試劑盒 3：細(xì)菌、真菌 DNA 快速提取試劑盒、DNA 快速提取液 （1% Triton X-100，0.5% Tween 20，10mMTris·Cl （pH 8.0））、PCR 擴(kuò)增體系（2.5U/μL Taq DNAPolymerase、10×Taq Buffer、2.5mmol/L dNTPs、去離子
雙蒸水、20μmol/L 引物）、溶葡萄球菌酶。
2.2 方法
2.2.1 空氣樣品元基因組 DNA 提取方法
（1）樣品制備
采用摻菌法，以確保樣品中含有一定數(shù)量的微生物。具體方法如下：抽濾 250L 空氣，將先其中的懸浮物采集在 0.22μm 微孔濾膜上，用 1mL TE 緩沖液洗脫濾膜上采集的樣品，121℃滅菌 30min 后加入1.3×10 7 cfu 的大腸桿菌和 2.7×10 7 cfu 的金黃色葡萄球菌，10000rpm 離心 5min，棄上清，沉淀用于 DNA提取。
（2）元基因組 DNA 提取
采用試劑盒 1、試劑盒 2、試劑盒 3（提取方法參說明書）和 DNA 快速提取液進(jìn)行 DNA 提取。DNA快速提取液提取方法為：在樣品中加入 300μL 的提取液，100℃煮沸 5min，10000rpm 離心 5min，得上清為元基因組 DNA，用 0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
（3）元基因組 DNA 檢驗(yàn)
得到的元基因組 DNA 采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定 OD 260nm ，計(jì)算得 DNA 得率，并分別用大腸桿菌特異 引 物 （Alr1:5’-CTGGAAGAGGCTAGCCTGGAC－GAG-3’和 Alr2 :5’-AAAATCGGCACC GGTGGAGC－GATC-3’）[10]和金黃色萄球菌特異引物（nucF:
5' -GCGATTGAT GGTGATACGGTI-3' 和 nucR:5'-AGCCAAGCCTT GACGAACTAAAGC -3'） [11] 進(jìn) 行PCR 擴(kuò)增，進(jìn)一步比較不同實(shí)驗(yàn)方法提取 DNA 的效果。
2.2.2 空氣樣品采集方法
將過濾式空氣采樣器通過真空膠管鏈接于SHB-3 循環(huán)水多用真空抽氣泵（抽氣量 10L/min），根據(jù)濾膜孔徑和抽濾時(shí)間設(shè)計(jì)如下采集方案（表 1）：樣品采集結(jié)束后，用 TE 緩沖液將采集物從微孔濾膜上洗脫下來，然后用 1.2.1.2 確定的方法提取元基因組 DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并采用細(xì)菌16S rDNA 通用引物 27F（5’- AGAGTTTGATCMTG－GCTCAG-3’）和 1525R（5’-AGAAAGGAGGTGWTC－CARCC -3’）[12] 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，檢驗(yàn)提取 DNA 的質(zhì)量。25μl 擴(kuò)增體系中加 1μl DNA 模板，2U Taq DNA聚合酶，其它為常規(guī)用量。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4min，95℃變性 45s，55℃退火 90s，72℃延伸 1min，72℃后延伸 5min，30 循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，0.7%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。
3 結(jié) 果
3.1 樣品 DNA 提取方法的確定
根據(jù) OD 260nm 測(cè)定結(jié)果計(jì)算得到的采用摻菌法各方法提取 DNA 的得率見表 2，結(jié)果表明：試劑盒 1DNA 提取得率最高，且重現(xiàn)性好，試劑盒 2 和快速DNA 提取液 DNA 得率明顯低于試劑盒 1，而試劑盒3 DNA 得率最低。根據(jù)元基因組 DNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖 1）：各方法提取得到的 DNA 分子量都在 20kb 以上，調(diào)帶較為整齊。采用所提的元基因組 DNA 進(jìn)行大腸桿菌和金黃色葡萄球菌特異引物擴(kuò)增的結(jié)果如圖 2 所示。
總體來看，除試劑盒 3 外，其它三種方法得到的 DNA 都得到了大腸桿菌的特異擴(kuò)增產(chǎn)物片段（約 370bp），且試劑盒 1 提取得到的 DNA 的擴(kuò)增效果最好；雖然試劑盒 1、試劑盒 2 提取的 DNA 樣品得到了金黃色葡萄球菌特異擴(kuò)增片段（約 290bp），但是擴(kuò)增效果較差。說明即使是試劑盒 1，對(duì)金黃色葡萄球菌 DNA 的提取效果也較差。因此，以效果最好的試劑盒 1 提取法為基礎(chǔ)，對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了如下改進(jìn)：（1）在第 2 步 37℃水浴時(shí)加入 12U 的溶葡萄球
菌酶，并將水浴時(shí)間和第 3 步 65℃水浴時(shí)間延長到30min～60min。
（2）將使用說明中第 9 步改為：加入二倍體積的冰乙醇，充分混勻，10000rpm 離心 10min，小心倒掉上層懸液；加入適量體積的 70%乙醇，輕輕彈離心管的底部使 DNA 懸浮后，10000rpm 離心 10min，棄乙醇，晾干；最后用 30μl 洗脫緩沖液 EB 溶解沉淀即可。
實(shí)驗(yàn)方法改進(jìn)前后 DNA 特異引物擴(kuò)增結(jié)果比較見圖 3，顯然改進(jìn)提取方法后大腸桿菌和金黃色葡萄球菌特異擴(kuò)增效率均有所提高，尤其是金黃色葡萄球菌的擴(kuò)增效率改善明顯。
3.2 不同采樣方法效果的比較
上述結(jié)果說明改進(jìn)的提取方法對(duì)革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌都適用，因此以改進(jìn)的試劑盒 1 提取方法為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)不同采樣方法所得樣品是否滿足元基因組 DNA 提取及 PCR 擴(kuò)增要求。檢測(cè)結(jié)果如圖 4 所示：結(jié)果顯示：用兩種孔徑的微孔濾膜采集 30min所得樣品均不能提取得到滿足普通 PCR 檢測(cè)所需的 DNA；而用兩種孔徑的微孔濾膜采集 45min 和60min 所得樣品均可提取得到滿足普通 PCR 要求的DNA，但總體上 0.22μm 微孔濾膜采集所得樣品提取DNA 后擴(kuò)增效果要比 0.45μm 微孔濾膜好，并且采集時(shí)間在 60min 時(shí)所得 DNA 擴(kuò)增效率最高。說明采集 30min 時(shí)所得樣品中微生物數(shù)量太少，尚不足以提取得到滿足普通 PCR 檢測(cè)的 DNA，采集 45min 時(shí)所得樣品中微生物數(shù)量雖已可提取得到滿足普通PCR 檢測(cè)靈敏度要求量的 DNA。但若適當(dāng)延長采樣時(shí)間，增加采集的空氣體積，則對(duì)于分析空氣中低豐度的微生物更合適些。
4 討 論
目前空氣微生物樣品采集多采用撞擊法或自然沉降法，這兩種方法均以培養(yǎng)為基礎(chǔ)檢測(cè)微生物 [13] 。在飛船上，環(huán)境微生物檢測(cè)需快速、敏感，而傳統(tǒng)的培養(yǎng)法無法滿足此要求。免培養(yǎng)法能達(dá)到快速、高效、準(zhǔn)確檢測(cè)微生物的目的，已成為研究各類環(huán)境微生物多樣性的重要方法，但是在空氣微生物多樣性研究領(lǐng)域尚未得到廣泛應(yīng)用，其主要原因在于沒有有效的適于免培養(yǎng)應(yīng)用的空氣微生物采樣及元基因組 DNA 提取方法 [14-16] 。
本研究發(fā)現(xiàn)與其他試劑比較，試劑盒 1 對(duì)于元基因組 DNA 的提取效率最高。對(duì)提取液的組成、原理和方法進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)快速提取液法通過煮沸去除核酸內(nèi)切酶，但有資料顯示，有一些菌株含有的核酸內(nèi)切酶靠煮沸是無法完全去除的，如含有 en－dA+基因型的菌株；此外，試劑盒 2 和試劑盒 3 所采用的方法在細(xì)胞破壁后，DNA 與核酸內(nèi)切酶仍有充分接觸時(shí)間，DNA 有可能被降解；而離心柱分離通過吸附、快速漂洗和離心，減小了核酸內(nèi)切酶與 DNA作用的面積和時(shí)間，并能有效的去除細(xì)胞代謝產(chǎn)物、蛋白等雜質(zhì)，最后所得到的洗脫的基因組 DNA 純度較高。
使用提取模板擴(kuò)增特異片段時(shí)發(fā)現(xiàn)即使是試劑盒 1，對(duì)金黃色葡萄球菌 DNA 的擴(kuò)增效果也較差。這可能與革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)影響提取效果有關(guān)。因此在改進(jìn)方法中，加入了溶葡萄球菌酶和二倍體積的冰乙醇促進(jìn)細(xì)菌壁的裂解，至此，改進(jìn)的提取方法對(duì)革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌均適用。
本研究建立了可用于免培養(yǎng)研究的室內(nèi)空氣微生物采集及 DNA 提取方法，所得 DNA 樣品滿足普通 PCR 檢測(cè)需要，為空氣樣品微生物的免培養(yǎng)研究奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。